Na terenie całego obozu zagłady przebywało jednorazowo około 1 000 więźniów. Ilość ta zmieniała się w zależności od potrzeb niemieckiej obsługi. Rotacja wśród więźniów była duża. Chorych i słabych odsyłano do komór, a na ich miejsce wybierano więźniów z tłumu przybyłych. Więźniowie podzieleni byli na komanda:

• Tornungskommando specjalizowało się w kamuflażu ogrodzenia.
• Kommando Rot – komando czerwone, zajmowało się sortowaniem rzeczy po zamordowanych, które znajdowały się na placu.
• Kommando Gelb – komando żółte – tzw. szmaciarze, pracowali wewnątrz baraku i zajmowali się klasyfikacją odzieży według jakości i usuwaniem z niej wszelkich oznak żydowskiego pochodzenia, takich jak gwiazdy Dawida, naszyte nazwiska czy zapomniane dokumenty.
• Kommando Blau – komando niebieskie – obsługiwało fikcyjny dworzec. Otwierali przybyłe tu wagony, wynosili bagaże i zmarłych podczas transportu, czyścili i dezynfekowali wagony.
• Desinfektionskommando – komando dezynfekcyjne – zajmowało się dezynfekcją gromadzonych ubrań oraz ściętych włosów kobiecych.
• Goldjudeni zajmowali się segregowaniem i oszacowaniem kosztowności. Przebywała też tutaj grupa rzemieślników różnych specjalności, wśród których byli m.in. krawcy. Nosili oni żółte opaski lub łaty.

Więźniowie wstawali około godz. 5, najpierw odbywał się apel poranny, później jedli śniadanie złożone z suchego chleba i kawy lub chlebowej zupy (rozwodniony czerstwy chleb), potem udawali się do pracy, która trwała co najmniej do godz. 18. Obiad spożywano w godzinach 12–13. W czasie, gdy przychodziły do obozu transporty, więźniowie byli w miarę dobrze odżywiani, gdyż spożywano produkty, które przywozili ze sobą deportowani tu ludzie. Gdy transporty nie nadchodziły, sytuacja zmieniała się radykalnie.

Na czele więźniów obozu nr 1, liczącego około 700 osób, stał, pochodzący z Łodzi, inżynier Galewski, a w czasie jego choroby – Rakowski. Galewski robił, co mógł, by poprawić warunki życia więźniom. Stanął też na czele komitetu organizacyjnego przygotowującego powstanie.

Więźniowie w obozie nr 2 zajmowali się wyciąganiem zwłok z komór gazowych i ich paleniem. Było ich około 300, a przewodził im początkowo Singer, a później wiedeński Żyd o nazwisku Blau.

Więźniowie za wszelkiego rodzaju przewinienia byli karani. Powszechnie stosowaną karą było przywiązywanie więźnia do drabiny, służącej do wejścia na wieżę strażniczą, i bicie go biczami czy pałkami drewnianymi minimum 25 razy. Często przywiązywano więźnia, pozbawiając go możliwości wykonania jakiegokolwiek ruchu, i pozostawiano go tak na wiele godzin. Wykonywano również karę śmierci przez powieszenie na szubienicy, często „do góry nogami”.

Hymn Treblinki
Fester Schritt und Tritt
Und der Blick gerade aus
Immer mutig und treu
In der Welt geschaut
Marschieren Kolonnen zur Arbeit
Darum sind wir heute in Treblinka
Das unser Schicsal ist tara-ra
Darum sind wir heute in Treblinka
Und gestellt in kurzer Frist
Wir hören auf den Ton des Kommandanten
Und folgen ihm auf den Wink
Wir gehen jeden Tritt und Schritt zusammen
Für alle, was dir Pflicht von uns verlangt
Die Arbeit soll alles hier Bedeuten
Und auch Gehorchsamkeit und Pflicht;
Wir werden weiter, weiter leisten,
Bis das kleine Glück gibt einmalein Wink
Hu – Ha!

W wolnym tłumaczeniu:

Twardy krok i śmiałe spojrzenie,
zawsze odważnie i wiernie
patrząc w świat,
maszerują kolumny do pracy.
Dlatego jesteśmy dzisiaj w Treblince,
bo nasz los jest tara-ra
Dlatego jesteśmy dzisiaj w Treblince,
gdyż nasza przyszłość jest krótka.
Wsłuchajmy się w ton komendanta
i śledźmy każdy jego znak.
Idziemy krok w krok razem,
we wszystkim, czego od nas oczekuje obowiązek.
Praca musi tutaj znaczyć wszystko,
tak jak posłuszeństwo i obowiązek.
Będziemy dokonywać więcej i więcej,
aż małe szczęście da nam choć raz znać.

(Źródło: Samuel Willenberg, Bunt w Treblince, Warszawa 1991, s. 66–67).